Parmi les pathologies affectant l'interstitium pulmonaire, la pneumoconiose du mineur de charbon est une des maladies pulmonaires fibrosantes les plus répandues. Causée la l'inhalation de poussières de charbon, elle se divise en deux groupes : la Pneumoconiose Simple (PS, lésions fibrotiques limitées, opacités radiologiques inférieures à 1 cm) et la Fibrose Massive Progressive (FMP, réaction fibrosante périfocale et extensive avec altérations sévères de la fonction respiratoire). Bien que sa physiopathologie ne soit pas complètement élucidée, de nombreux travaux suggèrent la participation du macrophage alvéolaire (MA) dans la réaction inflammatoire caractérisée par une alvéolite principalement de type macrophagique. De part sa capacité à produire un large panel de médiateurs (métabolites de l'oxygène, enzymes, métabolites de l'acide arachidonique, cytokines) le MA jouent un rôle primordial dans la réaction inflammatoire pulmonaire.

Après avoir démontré la capacité des poussières de mine à activer le MA in vitro (Gosset et al, 1991), la détection des ARN messagers TNFα et IL-6 dans le tissu pulmonaire de patients pneumoconiotiques nous a permis de démontrer l'activation du MA in vivo. Au niveau cellulaire le pourcentage de MA exprimant les ARN messagers est significativement plus élevé chez les patients présentant une FMP par comparaison aux PS et aux sujets témoins. Au niveau tissulaire les messagers TNFα et IL-6 sont uniquement observés pour les patients présentant une fibrose massive progressive. Les messagers IL-6 sont détectés au niveau des macrophages, mais d'autres types cellulaires comme les cellules endothéliales (CE) apparaissent elles aussi positives. La synthèse des protéines correspondantes est confirmée par immunohistochimie. Nous avons donc confirmé l'activation macrophagique chez les patients pneumoconiotiques ainsi que de l'existence d'une activation de l'endothélium vasculaire.

A coté d'une réaction inflammatoire chronique, la pneumoconiose du mineur de charbon est aussi caractérisée par un processus fibrosant. Il était donc primordial de déterminer le rôle des différents facteurs de croissance pour les fibroblastes sécrétés par le MA : PDGF, IGF-1, TGFβ. Le premier est connu pour être un facteur de croissance du type "compétence", l'IGF-1 : un facteur du type "progression". Le TGFβ est lui considéré comme un facteur de régulation de la prolifération fibroblastique. Tandis que les deux facteurs profibrosants : PDGF et IGF-1 sont sécrétés spontanément par les MA de patients et de façon exagérée par les MA de patients présentant une FMP comparativement aux PS, le TGFβ est détecté dans les surnageants de MA de patients présentant une PS. La détection de ces facteurs dans les liquides de lavage bronchoalvéolaire confirme un profil de sécrétion identique in vivo. Compte tenu de la dualité fonctionnelle du TGFβ, ces résultats préliminaires ont permis de bâtir l'hypothèse selon laquelle le TGFβ serait un facteur potentiel de protection du développement de la fibrose pulmonaire ainsi que de la réaction inflammatoire observée dans la pneumoconiose du mineur de charbon.

Dans la première partie nous avions démontré l'activation de la CE dans le poumon pneumoconiotique. De part sa situation elle joue un rôle important dans le contrôle de l'afflux cellulaire, dans le cas présent de macrophages, vers l'alvéole par l'expression de molécule d'adhérence cellulaire : principalement ELAM-1, ICAM-1, VCAM-1. Afin d'étudier le comportement de la CE dans une situation de réaction inflammatoire chronique, nous avons mis en place un modèle in vitro de réaction chronique mimée par l'addition répétée d'un stimulus inflammatoire : le TNFα. Nous avons évalué la réaction de la cellule endothéliale dans deux conditions : réaction inflammatoire aiguë et réaction inflammatoire chronique. Le modèle de réaction inflammatoire chronique nous montre que, contrairement à la situation aiguë (une dose unique de TNFα), l'addition de TNFα de façon répétée induit une expression importante et persistante de l'ICAM-1. De plus l'expression est maintenue même en absence de TNFα détectable dans le surnageant de culture. Il semble donc qu'une très faible addition de TNFα suffise à maintenir l'expression maximale de l'ICAM-1. Ces résultats permettent d'envisager un mécanisme nouveau dans la régulation de l'expression des molécules d'adhérence et en particulier de l'ICAM-1 au cours de la pneumoconiose.

Les macrophages alvéolaires sont présents en grand nombre dans les poumons de patients présentant une Pneumoconiose du mineur de charbon. Chez ces patients ces cellules produisent des taux accrus d'un large panel de médiateurs et de cytokines. Alors que la charge en particules inhalées est souvent similaire chez les mineurs de charbon, et malgré la capacité intrinsèque des poussières d'induire la production de tous les médiateurs, les différences qualitatives et quantitatives des sécrétions macrophagiques peuvent représenter une explication intéressante des différences observées entre Pneumoconiose Simple et Fibrose Massive Progressive. Certains mineurs, en raison d' un profil de sécrétion des cytokines différents peuvent développer, malgré une exposition au risque similaire, une forme plus sévère de pneumoconiose avec des lésions pulmonaires plus étendues et une diminution de la fonction respiratoire. Il apparaît donc que l'évaluation du profil de sécrétion des cytokines, et en particulier le TGFβ, puissent ouvrir de nouvelles issues dans la compréhension des mécanismes physiopathologiques de la pneumoconiose mais aussi probablement d'autres pathologies interstitielles affectant le tissu pulmonaire.

La mucoviscidose est causée par une mutation dans le gène CFTR (Cystic Fibrosis transmenbrane conductance Regulator gene) qui code pour un canal chlore présent à la surface des cellules épithéliales. La mutation la plus fréquente a pour effet de bloquer l'expression de la protéine à la membrane. La maturation de la protéine est en fait bloquée au niveau du réticulum endoplasmique. Une approche moléculaire de l'étude des mécanisme de cette rétention a été entreprise. Nous avons produit différentes constructions génétiques codant pour des variants du CFTR dans lesquels les différents domaines constituants le CFTR ont été "déplacés".

Pour ce faire, l'ADN complémentaire a été mutagénisé de façon à introduire 4 sites de restrictions de part et d'autre des domaines NBF (CFTR 4m). Partant de cette construction, différents variants moléculaires ont été construits en modifiant la position des domaines NBF. L'expression et la maturation intracellulaire des molécules CFTR modifiées ont été suivies par Western Blot. La fonction a par la suite été analysée par mesure de l'efflux de Chlore 36. L'expression transitoire des molécules CFTR2xNBF1, CFTR2xNBF2, CFTRDNBF1, CFTRDNBF2, CFTRNBF2-1 en cellules COS montre que seule la construction CFTRDNBF2 conduit à une molécule CFTR qui est présente à la membrane mais inactive. Cette approche nous a donc confirmé le rôle essentiel du domaine NBF1 dans la maturation de la protéine et notamment dans le reploiement de la molécule entière. Toutefois, le seule présence des domaines formant le canal (les 12 domaines transmembranaires) ne sont pas suffisant pour le transport du Chlore.

Suivant un autre axe de travail, le fragment d'ADNc codant pour le domaine NBF1 a été cloné dans un vecteur d'expression procaryote, cette approche devant nous permettre d'analyser après purification la structure de ce domaine et de bâtir de nouvelles hypothèses quant aux possibles interactions entre ce domaine et les autres domaines du CFTR. Nous avons bâti un premier protocole de purification simple (lyse, centrifugation, solubilisation en urée, échange d'ions, tamisage moléculaire, dialyse) qui nous a permis d'obtenir 1 mg d'une protéine pure à environ 90%. Nous n'avons pas pu obtenir des quantités supérieures pour des problèmes de scale-up dans le processus.